Cancer Angiogenesis

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from pre-existing vessels; This process involves the microcirculation endothelium and especially the venous endothelial component and is mediated by a series of pro-angiogenic factors, which activate the dormant endothelial cells of the healthy peritumoral endothelium inducing the formation of an endothelial token, which is destined to propagate and increase in size, giving rise to a complex vascular network.
This process is crucial for the expansion of the tumor as the first tumor cells growing within healthy tissue can proliferate thanks to oxygen and nutrients from the host vessels, but when the distance between the cell and vessel of 100-200 microns is exceeded, simple diffusion from existing vessels is no longer sufficient.

In fact, a tumor mass can remain viable up to a diameter of 1/2mm, beyond which it enters a dormant state, a stationary state in which it is said to be dormant (it does not disappear, but it does not progress either). When new vessels arrive, the masserella, which may have been dormant for years in a steady state, may begin to grow when the angiogenic switch takes place.
This process is the result of the production of pro-angiogenetic factors by tumor cells, but not only because the stromal components (fibroblasts, macrophages, neutrophils, mast cells) are also cells that can secrete angiogenetic factors, promoting tumor growth.
The process of angiogenesis consists of various phases:

-The first thing an endothelium must do in order to give rise to a new vascular network is degrade the basal membrane (physical obstacle to the formation of the endothelial token), composed of laminin, collagen IV and other proteins, which therefore require the secretion by the endothelial cells of a series of ** proteolytic enzymes** capable of degrading them.

-Once the basal membrane is degraded, there is the extracellular matrix which must also be degraded by other enzymes (the composition of the basal membrane is not identical to that of the extracellular matrix, in the first there is type IV collagen, while in the second interstitial collagen type I). In this way we begin to create a space within which to build the new vascular network. Generally these first phases go in parallel with an increase in the permeability of the endothelium and the detachment of the pericytes from the endothelium itself.

-Once this gap is opened, the endothelial cells begin to migrate under ** chemo-tactic stimulation, exerted by the angiogenetic and pro-angiogenic factors that come from the tumor cells themselves.
This creates a solid lumenless ** endothelial token, characterized by an invasive front, where the endothelial cells migrate and continue to degrade the extracellular matrix, followed by a neck of actively proliferating endothelial cells. The cells of the migratory front are called tip cells, while those of the neck stalk cells. The token lengthens in a directional way thanks to the migratory activity of the first front of cells that do not divide but simply advance and thanks to the cells behind them that continue to proliferate, the token lengthens and branches.
This token maintains contact with the endothelial cells of the original jar and is not yet a jar, as it has no lumen and no blood is still circulating inside it.

-When endothelial tokens converge and merge with each other, migratory and proliferative phenomena stop and the morphogenetic phase of this token begins. The endothelial cells, until now cuboid in shape, flatten, thus creating a lume inside the token that becomes a real vase; moreover, the endothelial cells begin to secrete proteins from the extracellular matrix and recall the pericytes, which return to the endothelium to form the wall component of the same, contributing to the production of the extracellular matrix, which will then give rise to the new basal membrane. At this point the vascular network has been created and the blood that flowed into the original vessel begins to flow into these new vessels as well.

As said, the process is favoured by angiogenetic factors, of which there are various types, they can be growth factors (for example TNF),cytokines (such as IL-1 or IL-8) or chemokines.
Among the most important growth factors we find the family of VEGF (vascular endothelial growth factor), which seems to play an important role in physiological and pathological angiogenesis and therefore a predominant role in tumor growth It can be produced by tumor cells, M2 polarized macrophages, mast cells, fibroblasts. There are different types of VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E), but the most important seems to be the VEGF-A.

There are also different receptors for VEGF (VEGF receptor-1, 2, 3), which bind different members of the VEGF family and the most important coupling is between VEGF-A and VEGF receptor-2.
When VEGF-A (produced by any cellular type) interacts with the receptor expressed on the endothelial surface, it activates a series of endothelial responses, starting a cascade of transduction signals that are typical of tyrosine kinase receptors.

The activation of this receptor is sufficient to induce in the endothelium all the responses we have seen such as: it stimulates the production of proteolytic enzymes, induces the chemotactic response (endothelial cell migration), induces the proliferation of endothelial cells and induces an increase in permeability.

Stimulus for VEGF production

The production of VEGF is in turn induced by various stimuli:

-activation of oncogenes
-Molecules that are themselves pro-angiogenic...
-Jossia: a low pO2 in a microenvironment induces as an adaptive response a stimulation to the production of new vessels mediated by molecular biochemical sensors of pO2, capable of giving rise to the cellular response, which includes the production of VEGF.

The response to hypoxia is mainly mediated by a transcriptional factor, which is called HIF (hypoxia inducible factor).
The cell continuously produces HIF but, under normal conditions, newly produced HIF is ubiquitated and degraded to proteasome level. The ubiquitination of HIF depends on its hydroxylation, which in turn depends on the enzyme prolil-hydroxylase, an O2-sensitive enzyme (because it contains a Fe atom) that only works under normal conditions. Under normal conditions the enzyme then works and hydroxylase HIF neosynthetized which is then ubiquitated and degraded.
However, when pO2 drops and prolyl-hydroxylase stops working, HIF can no longer be hydroxytized (and therefore ubiquitated) and moves to the nucleus where it binds appropriate nucleotide sequences called HRE (hypoxia responsive elements), regulatory regions upstream of a series of genes. Among these hundreds of genes, there is also the gene for VEGF like many others.

The cells of our organism are able to produce not only pro-angiogenic factors, but also anti-angiogenic factors, to ensure adequate control of the phenomenon, which is very important in physiology.
A typical anti-angiogenic protein is thrombospondin, a protein of the matrix that has a strong anti-angiogenic activity. What happens in a tumor when an angiogenetic switch occurs is the loss of homeostasis, of balance: an increased production of pro-angiogenic factors is observed which is accompanied by a decreased production of anti-angiogenic factors.
In addition, interferon is also a substance able to inhibit the growth of vessels, used for example in therapy to treat the hemangiomas of newborns.

Therefore, angiogenesis in cancer is the result of a disorderly, excessive production of pro-angiogenic factors, which continue to chaotically stimulate the endothelium to induce new vessels. The evident organizational chaos of the vascular network is therefore the result of a chaos in the secretion of angiogenic factors with conesguent formation of a new vascular network imperfect from an organizational, hierarchical, structural, functional point of view.

Drugs acting on angiogenesis

The vascular component of the tumor has consequences on the biology of the tumor itself, determining the proliferating areas and areas of necrosis, but also determines the access of a drug to the tumor cells. The most sprayed areas can potentially be more easily reached by a drug.

Low molecular weight drugs spread from the blood to the crevice as a function of their concentration gradient while high molecular weight substances (such as antibodies) spread as a function of pressure. In cancer, however, the interstitial hydrostatic pressure is higher than that of healthy tissue and this tends to counteract the mechanisms of diffusion by concentration gradient.

As a result, today there are techniques that try to normalize the vascular permeability at tumor level in order to reduce the interstitial hydrostatic pressure and promote the action of drugs.
The use of therapeutic antibodies instead is limited precisely by these problems of accessibility of the antibody to the parenchyma.

Many studies carried out on patients also show that vascularization is also important from a clinical point of view: strongly vascularized tumors make the prognosis more inauspicious (these tumors grow more and metastasize more).

All this has led to the idea that by blocking the vascularization of a tumor with an anti-angiogenic drug, the growth of the tumor is also blocked. The first anti-angiogenic drug that was approved was Avastin (an antibody capable of binding and inhibiting VEGF activity). On its own it has little therapeutic success, but it seems to work better when co-administered with other classic anti-tumor drugs; it seems to be more effective in attacking both the vascular and parenchymal networks at the same time.
To date, however, in anti-neoplastic therapy the anti-angiogenic approach has not yet achieved the expected results, especially because the tumor produces many different angiogenic factors, so if a drug is used against a certain type of factor, the tumor is able to adapt, developing alternative strategies and mechanisms of resistance to therapy, producing other angiogenic factors.

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Angiogenesi Tumorale

L’angiogenesi rappresenta quel processo attraverso cui vi è la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da vasi preesistenti; tale processo coinvolge l’endotelio del microcircolo e soprattutto la componente endoteliale venosa ed è mediato da una serie di fattori pro-angiogenetici, che attivano le cellule endoteliali quiescenti dell’endotelio sano peritumorale inducendo la formazione di un gettone endoteliale, che è destinato a propagarsi e ad aumentare di dimensioni, dando origine ad una rete vascolare complessa.
Tale processo risulta fondamentale per l’espansione del tumore in quanto le prime cellule tumorali che crescono all’interno di un tessuto sano possono proliferare grazie all’ossigeno e alle sostanze nutritive che provengono dai vasi dell’ospite, ma quando si supera la distanza tra cellula e vaso di 100-200 micron, la semplice diffusione dai vasi preesistenti non è più sufficiente.

Infatti una masserella tumorale può mantenersi vitale fino a un diametro di 1/2mm, oltre il quale la masserella entra in uno stato di quiescenza, uno stato stazionario in cui si dice dormiente (non scompare, ma non progredisce neanche). Quando arrivano nuovi vasi, la masserella che può essere stata quiescente anche per anni in stato stazionario può iniziare a crescere nel momento si attua lo switch angiogenetico.
Questo processo è la risultante della produzione di fattori pro-angiogenetici da parte delle cellule tumorali, ma non solo in quanto anche le componenti stromali (fibroblasti, macrofagi, neutrofili, mastociti) sono cellule che possono secernere fattori angiogenetici, favorendo la crescita tumorale.
Il processo di angiogenesi consta di varie fasi:

-La prima cosa che deve fare un endotelio per poter dare origine a una nuova rete vascolare è degradare la membrana basale (ostacolo fisico alla formazione del gettone endoteliale), composta da laminina, collagene IV e altre proteine, che richiedono dunque la secrezione da parte delle cellule endoteliali di una serie di enzimi proteolitici in grado di degradarle.

-Una volta degradata la membrana basale, c’è la matrice extracellulare che dovrà essere anch’essa degradata da parte di altri enzimi (la composizione della membrana basale non è infatti identica a quella della matrice extracellulare, nella prima c’è collagene di tipo IV, mentre nella seconda collagene interstiziale di tipo I). Si inizia a creare così uno spazio all’interno del quale poter costruire la nuova rete vascolare. Generalmente queste prime fasi vanno in parallelo con un aumento della permeabilità dell’endotelio e il distacco dei periciti dall’endotelio stesso.

-Una volta apertosi questo varco, le cellule endoteliali iniziano a migrare sotto stimolazione chemiotattica, esercitata dai fattori angiogenetici e pro-angiogenici che provengono dalle cellule tumorali stesse.
Si crea così un gettone endoteliale solido privo di lume, caratterizzato da un fronte invasivo, dove le cellule endoteliali migrano e continuano a degradare la matrice extracellulare, seguito da un collo di cellule endoteliali in attiva proliferazione. Le cellule del fronte migratorio prendono il nome di tip cells, mentre quelle del collo stalk cells. Il gettone si allunga in modo direzionale grazie all’attività migratoria del primo fronte di cellule che non si dividono ma avanzano semplicemente e grazie alle cellule retrostanti che continuano a proliferare, il gettone si allunga e si ramifica.
Tale gettone mantiene il contatto con le cellule endoteliali del vaso di origine e non è ancora un vaso, in quanto privo di lume e al suo interno non circola ancora sangue.

-Quando i gettoni endoteliali convergono tra di loro e si fondono l’uno con l’altro, si arrestano i fenomeni migratori e proliferativi e inizia la fase morfogenetica di questo gettone. Le cellule endoteliali, fino a questo momento di forma cuboide, si appiattiscono, creando così un lume all’interno del gettone che diventa un vero e proprio vaso; inoltre le cellule endoteliali iniziano a secernere proteine della matrice extracellulare e richiamano i periciti, che tornano sull’endotelio a costituire la componente murale dello stesso, concorrendo alla produzione della matrice extracellulare, che poi darà origine alla nuova membrana basale. A questo punto la rete vascolare è stata creata e il sangue che fluiva nel vaso originario inizia a fluire anche in questi nuovi vasi.

Come detto il processo è favorito dai fattori angiogenetici, di cui ve ne sono varie tipologie, possono essere infatti fattori di crescita (per esempio TNF),** citochine** (come IL-1 o IL-8) o chemochine.
Tra i più importanti fattori di crescita troviamo la famiglia di VEGF (vascular endothelial growth factor), che sembra giocare un ruolo importante nell’angiogenesi fisiologica e patologica e dunque un ruolo predominante nella crescita tumorale Esso può essere prodotto dalle cellule tumorali, dai macrofagi polarizzati in senso M2, dai mastociti, dai fibroblasti. Esistono diversi tipi di VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E), ma il più importante sembra essere il VEGF-A.

Esistono anche diversi recettori per VEGF (VEGF receptor-1, 2, 3), che legano diversi membri della famiglia di VEGF e l’accoppiata più importante è quella tra VEGF-A e VEGF receptor-2.
Quando VEGF-A (prodotto da qualsiasi tipo cellulare) interagisce con il recettore espresso sulla superficie endoteliale, attiva una serie di risposte a carico dell’endotelio, avviando una cascata di segnali di trasduzione che sono tipici dei recettori tirosin-chinasici.

L’attivazione di questo recettore è sufficiente per indurre nell’endotelio tutte le risposte che abbiamo visto quali: la stimola la produzione di enzimi proteolitici, induce la risposta chemiotattica (migrazione delle cellule endoteliali), induce la proliferazione delle cellule endoteliali e induce un aumento della permeabilità.

Stimoli per la produzione di VEGF

La produzione di VEGF a sua volta viene indotta da diversi stimoli:

-Attivazione di oncogeni
-Molecole a loro volta pro-angiogeniche (IL-8, FGF…)
-Ipossia: una bassa pO2 in un microambiente induce come risposta adattativa una stimolazione alla produzione di nuovi vasi mediata da sensori molecolari biochimici di pO2, in grado di dare origine alla risposta cellulare, che include la produzione di VEGF.

La risposta all’ipossia è mediata principalmente da un fattore trascrizionale, che prende il nome di HIF (hypoxia inducible factor).
La cellula produce in continuazione HIF ma, in condizioni di normossia, HIF appena prodotto viene ubiquitinato e degradato a livello del proteasoma. L’ubiquitinazione di HIF dipende dalla sua idrossilazione, che a sua volta dipende dall’enzima prolil-idrossilasi, enzima sensibile all’O2 (perché contiene un atomo di Fe) che funziona solo in condizioni di normossia. In condizioni di normossia quindi l’enzima funziona e idrossila HIF neosisntetizzato che viene poi quindi ubiquitinato e degradato.
Quando però la pO2 scende e la prolil-idrossilasi smette di funzionare, HIF non può più essere idrossilato (e quindi ubiquitinato) e trasloca al nucleo dove lega opportune sequenze nucleotidiche dette HRE (hypoxia responsive elements), regioni regolatrici a monte di una serie di geni. Tra questo centinaio di geni, c’è anche il gene per le VEGF come tanti altri.

Le cellule del nostro organismo sono in grado di produrre non solo fattori pro-angiogenici, ma anche fattori anti-angiogenici, per garantire un adeguato controllo del fenomeno, fatto importantissimo in fisiologia.
Una proteina tipica anti-angiogenica è la trombospondina, una proteina della matrice che ha una spiccata attività anti-angiogenetica. Quello che accade in un tumore quando avviene uno switch angiogenetico è la perdita dell’omeostasi, dell’equilibrio: si osserva un’aumentata produzione di fattori pro-angiogenici che si accompagna a una diminuita produzione di fattori anti-angiogenici.
Inoltre anche l’interferone è una sostanza in grado di inibire la crescita dei vasi, usata per esempio nella terapia per curare gli emangiomi dei neonati.

Dunque l’angiogenesi nel tumore è il risultato di una disordinata, eccessiva produzione di fattori pro-angiogenici, che continuano a stimolare in maniera caotica l’endotelio a indurre nuovi vasi. L’evidente caos organizzativo della rete vascolare è dunque la risultante di un caos nella secrezione di fattori angiogenici con conesguente formazione di una nuova rete vascolare imperfetta da un punto di vista organizzativo, gerarchico, strutturale, funzionale.

Farmaci che agiscono sull'angiogenesi

La componente vascolare del tumore ha conseguenze sulla biologia del tumore stesso, determinando le aree proliferanti e le aree di necrosi, ma determina anche l’accesso di un farmaco alle cellule tumorali. Le zone più irrorate potenzialmente possono essere raggiunte più facilmente da un farmaco.

Farmaci a basso peso molecolare diffondono dal sangue all’interstizio in funzione del loro gradiente di concentrazione mentre le sostanze ad alto peso molecolare (come gli anticorpi), invece, diffondono in funzione delle pressioni. Nel tumore però la pressione idrostatica interstiziale è più elevata rispetto a quella di un tessuto sano e questo tende a contrastare i meccanismi di diffusione per gradiente di concentrazione.

In virtù di ciò oggi ci sono tecniche che cercano di normalizzare la permeabilità vascolare a livello del tumore in modo tale da ridurre la pressione idrostatica interstiziale e favorire l’azione dei farmaci.
L’utilizzo di anticorpi terapeutici invece è limitato proprio da questi problemi di accessibilità dell’anticorpo nei confronti del parenchima.

Molti studi effettuati sui pazienti inoltre dimostrano che la vascolarizzazione è importante anche da un punto di vista clinico: tumori fortemente vascolarizzati fanno sì che la prognosi sia più infausta (questi tumori crescono di più e metastatizzano di più).

Tutto ciò ha fatto sì che si evolvesse l’idea secondo la quale, bloccando la vascolarizzazione di un tumore con un farmaco anti-angiogenico, si blocca anche la crescita dello stesso. Il primo farmaco anti-angiogenetico che è stato approvato è stato l’Avastin (anticorpo in grado di legare e inibire l’attività di VEGF). Da solo esso ha scarso successo terapeutico, ma sembra funzionare meglio se cosomministrato con altri farmaci anti-tumorali classici; sembra che sia più efficace aggredire contemporaneamente la rete vascolare e quella parenchimale.
Ad oggi comunque nella terapia anti-neoplastica l’approccio anti-angiogenetico non ha ancora raggiunto i risultati sperati, specialmente per via del fatto che il tumore produce tanti diversi fattori angiogenetici, per cui, se si usa un farmaco contro un certo tipo di fattore, il tumore è in grado di adattarsi, elaborando strategie alternative e meccanismi di resistenza alla terapia, producendo altri fattori angiogenici.

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Fonti/Sources

ifom

melanomaitalia

infomedics

news-medical

cnr

IEO

ema.europa

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Immagini/Pictures

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