My first experience with cell cultures - La mia prima esperienza con le colture cellulari

Hello everybody,

Today I would like to tell you how a simple cell biology laboratory experiment takes place. Everything will be divided into two stages: first of all it is necessary to determine the quantity of cells in an unknown biological sample and then color, in the aforementioned cells, the nuclear chromatin and the cellular cytoplasm.

Materials

To do all this, we first need to determine which tools and chemicals we have to use:

• Burker's chamber;
• 100 µL automatic pipette-pipettor with relevant tips;
• PBS;
• Methanol;
• Hematoxylin;
• Distilled water;
• Eosine.

Theoretical contents

The Burker chamber is one of the most common tools for cell counting. The latter could also be performed with an automatic counter that uses the laser, but the procedure is more laborious and the instrument requires constant maintenance. Furthermore, microscopic counting with hemocytometer is slower and more tiring, but allows the evaluation of the health status of the cells.

Hematoxylin is a positively violet-blue basic and charged dye that reveals substances such as DNA / RNA (chromatin), which are acidophilic and negatively charged.

Eosine, on the other hand, is an acid pink-red dye and negatively charged which reveals substances such as cytoplasmic proteins, which are basophils and positively charged.

Cell counting

To count the cells with the Burker chamber, the cell suspension is shaken well using a sterile 2 or 5 mL plastic pipette, avoiding the formation of bubbles and foam. Then, about 0.2 mL of suspension is taken and placed in a non-sterile Eppendorf tube.

The cells contained in the squares arranged on the diagonal of the chamber are then counted and the average number of cells per square is calculated. Burker's chamber has two sectors, one at the top and one at the bottom, each consisting of 12x12 = 144 squares of 1/250 µL. If you count the cells contained in the squares along the 4 diagonals of Burker's chamber, there are 48 small squares.

Knowing that each square corresponds to 1/250 of µL, the average number of cells per square is multiplied by 250, so as to have the cells in 1 µL in the suspension, and finally for 1000 so as to obtain the cells in 1 µL of the original suspension:

Number of cells in 1 mL = N / 24 x 250 x 1000.

Where 
N = number of cells inside the squares along the 4 diagonals of Burker's chamber = 13; 
24 = number of squares that make up the 2 diagonals of Burker's chamber; 
250 = factor that considers the volume of each square of the Burker chamber; 
1000 = conversion factor from µL to mL.

Number of cells = 13/24 x 250 x 1000 = 135 416.

Core and cytoplasm staining

For the coloring of our cell culture, the steps to be carried out are the following:

• With a pipette the culture medium present in multiwell is aspirated where the cells are plated on a slide;
• The slide is transferred into a Petri dish;
• Two washings are performed with PBS in the Petri dish;
• The cells on the slide are fixed by introducing methanol into the Petri dish;
• The cells fixed on the slide are stained by introducing a few drops of hematoxylin into the Petri dish;
• Let the dye work for 5 minutes at room temperature;
• Some washing is carried out with distilled water, until the water introduced into the Petri remains transparent;
• Eosin is added to the Petri dish and left to act for 5 minutes;
• Some washing is carried out with distilled water, until the water introduced into the Petri remains transparent;
• The slide is removed, excess water is allowed to dry and mounted on the object holder;
• It is observed that hematoxylin stains nuclear chromatin in blue and eosin stains in pink-red in cell cytoplasm.

Results

The images obtained by observation under the microscope are the following:

From the observation I can say that probably hematoxylin remained too little time in contact with the cells. In fact, the latter occur with a predominantly pink-red coloration, derived from eosine, and cellular nuclei are hard to notice, as they have not adequately colored. The cytoplasm, on the contrary, is clearly visible.

Nevertheless, for being my first experience in the world of cell biology I am satisfied, even if there are inaccuracies that will have to be corrected for the future. On the other hand, science is known to consist of continuous improvements and small steps.

Delilha

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ITA

Ciao a tutti,
Oggi vorrei raccontare come si svolge un semplice esperimento di laboratorio di biologia cellulare. Il tutto si dividerà in due momenti: prima è necessario determinare la quantità di cellule in un campione biologico incognito e poi si colora, nelle suddette cellule, la cromatina nucleare e il citoplasma cellulare.

Materiali

Per fare tutto ciò, innanzitutto bisogna determinare quali sono gli strumenti e le sostanze chimiche a nostra disposizione:

• Camera di Burker;
• Pipettatore automatico-pipetta automatica da 100 µL con relativi puntali;
• PBS;
• Metanolo;
• Ematossilina;
• Acqua distillata;
• Eosina.

Contenuti teorici

La camera di Burker è uno degli strumenti più comuni per il conteggio cellulare. Quest’ultimo potrebbe anche essere eseguito anche con un counter automatico che sfrutta il laser, ma la procedura è più laboriosa e lo strumento richiede costante manutenzione. Inoltre, il conteggio al microscopio con emocitometro è più lento e faticoso, ma permette di valutare lo stato di salute delle cellule.

L’ematossilina è un colorante basico e carico positivamente viola-blu che rivela sostanze come DNA/RNA (cromatina), i quali sono acidofili e carichi negativamente.

L’eosina, al contrario, è un colorante rosa-rosso acido e carico negativamente che rivela sostanze come le proteine citoplasmatiche, le quali sono basofile e cariche positivamente.

Conteggio delle cellule

Per contare le cellule con la camera di Burker, si agita bene la sospensione cellulare usando una pipetta di plastica sterile da 2 o 5 mL, evitando la formazione di bolle e schiuma. Quindi, si prelevano circa 0,2 mL di sospensione che vengono messi in una provetta Eppendorf non sterile.

Si contano poi le cellule contenute nei quadrati disposti sulle diagonali della camera e si calcola il numero medio di cellule per quadratino. La camera di Burker ha due settori, uno in alto e uno in basso, ciascuno costituito di 12x12 = 144 quadratini da 1/250 µL. Se si contano le cellule contenute nei quadratini lungo le 4 diagonali della camera di Burker, si contano 48 quadratini.

Sapendo che ogni quadratino corrisponde a 1/250 di µL, il numero medio di cellule per quadrato va moltiplicato per 250, in modo da avere le cellule in 1 µL nella sospensione, e infine per 1000 in modo da ottenere le cellule in 1 µL della sospensione originale:

Numero di cellule in 1 mL = N/24 x 250 x 1000. 
Dove 
N = numero di cellule all’interno dei quadratini lungo le 4 diagonali della camera di Burker = 13; 
24 = numero di quadrati che costituiscono le 2 diagonali della camera di Burker; 
250 = fattore che considera il volume di ciascun quadratino della camera di Burker; 
1000 = fattore di conversione da µL a mL. 

Numero di cellule = 13/24 x 250 x 1000 = 135 416.

Colorazione di nucleo e citoplasma

Per la colorazione della nostra coltura cellulare, i passaggi da effettuare sono i seguenti:

• Con una pipetta si aspira il terreno di coltura presente all’interno di multiwell dove si trovano le cellule piastrate su un vetrino;
• Si trasferisce il vetrino in una piastra Petri;
• Si effettuano due lavaggi con PBS nella capsula di Petri;
• Si fissano le cellule presenti sul vetrino introducendo nella Petri il metanolo;
• Si colorano le cellule fissate sul vetrino introducendo nella Petri qualche goccia di ematossilina;
• Si lascia agire il colorante per 5 minuti a temperatura ambiente;
• Si effettua qualche lavaggio con acqua distillata, fino a quando l’acqua introdotta nella Petri rimane trasparente;
• Si aggiunge nella Petri l’eosina e si fa agire per 5 minuti;
• Si effettua qualche lavaggio con acqua distillata, fino a quando l’acqua introdotta nella Petri rimane trasparente;
• Si preleva il vetrino, si lascia asciugare l’acqua in eccesso e si monta sul vetrino portaoggetto;
• Si osserva che l’ematossilina colora in blu la cromatina nucleare e l’eosina colora in rosa-rosso in citoplasma cellulare.

Risultati

Le immagini ottenute dall’osservazione al microscopio sono le seguenti:

Dall’osservazione posso dire che probabilmente l’ematossilina è rimasta troppo poco tempo a contatto con le cellule. Infatti, queste ultime si presentano con una colorazione predominante rosa-rosso, derivata dall’eosina, e si notano a fatica i nuclei cellulari, in quanto non si sono colorati in modo adeguato. Il citoplasma, al contrario, è ben visibile.

Ciò nonostante, per essere stata la mia prima esperienza nel mondo della biologia cellulare sono soddisfatta, anche se ci sono delle imprecisioni che dovranno essere corrette per il futuro. D’altra parte, la scienza, si sa, è fatta di miglioramenti continui e di piccoli passi.

Delilha