DETERMINACIÓN RÁPIDA DE COCAÍNA Y BENZOILECGONINA EN ORINA HUMANA POR CROMATOGRAFÍA DE GASES

Resumen El desarrollo de procedimientos analíticos para la determinación cuantitativa de drogas de abuso en matrices biológicas es de interés constante para propósitos forenses, para el seguimiento de tratamientos médicos así como también para la investigación del metabolismo de las mismas. La cocaína (COC), una de las drogas de abuso más utilizada, es rápidamente metabolizada en el organismo humano a uno de sus mayores metabolitos la benzoilecgonina (BZE), compuesto que contribuye a la toxicidad de la droga y que tiene un tiempo de vida de 4 a 6 veces mayor que la cocaína. En el presente trabajo se desarrolló un método para determinar COC y BZE en muestras de orina humana por cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas (CG-EM). La extracción de los analitos de interés desde las muestras de orina se realizó en una precolumna Oasis HLB (20 mm x 3.9 mm D.I.; dp= 25 μm Waters), incorporada a un sistema de inyección en flujo multijeringa (MSFIA) que se utilizó para realizar el tratamiento de la muestra. Finalmente para mejorar la volatilidad de la BZE, se realizó una reacción de derivatización con N,O-bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA) con 1 % de trimetilclorosilano (TMCS) asistida con microondas con el fin de disminuir el tiempo de reacción. Los resultados obtenidos demostraron que el método propuesto constituye una buena alternativa para el análisis de COC y BZE en muestras de orina ya que ofrece ventajas en comparación a los descritos en la literatura. Éstas incluyen simplicidad en el tratamiento de la muestra, selectividad y sensibilidad para determinar a los analitos de interés a los bajos niveles de concentración en los que se encuentran en la orina y una alta frecuencia de análisis. Abstract The development of analytical procedures for the quantitative determination of illegal drugs in biological matrices is of interest for forensic purposes, for the monitoring of medical treatments as well as for research on its metabolism. Cocaine (COC), one of the most widely used drugs, is rapidly metabolized in the human body to one of its major metabolites, benzoylecgonine (BZE), compound that contributes to the toxicity of drugs and has a lifespan of 4 to 6 times higher than cocaine.  In this paper, a method was developed to determine COC and BZE in human urine samples by gas chromatography with mass spectrometry detection (GC-MS). The extraction of analytes from urine samples was achieved in an Oasis HLB column (20 mm x 3.9 mm ID, dp = 25 m Waters), incorporated in a multi-syringe flow injection system (MSFIA), used for the sample treatment. Finally, to improve the volatility of the BZE, a derivatization reaction with N, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamida (BSTFA) with 1% trimethylchlorosilane (TMCS) was made microwave-assisted in order to reduce the reaction time.  The results showed that the proposed method is a good alternative for the analysis of COC and BZE in urine samples because it offers advantages compared to those described in the literature, which include simplicity in the sample treatment, the sensitivity and selectivity necessary to determine the analytes of interest at low levels in the urine and high sample throughput. Introducción La cocaína es un estimulante que actúa directamente sobre el sistema nervioso central, causando dependencia física, graves trastornos conductuales y riesgos nocivos para la salud. Existe una gran variedad de respuestas de los individuos hacia la COC y esta variabilidad es atribuida a diferencias en su farmacocinética y metabolismo. Una vez en el cuerpo, COC se metaboliza rápidamente en metabolitos hidrosolubles que se excretan por la orina como BZE (el principal metabolito de la COC) y en menor extensión como éster metílico de la ecgonina y ecgonina. En la literatura se encuentran reportados numerosos procedimientos de análisis por cromatografía para la determinación de la COC y BZE en diferentes matrices biológicas. La cromatografía de gases es la técnica más utilizada debido a su gran selectividad y sensibilidad, sin embargo, se requiere de una etapa de tratamiento de la muestra (extraer a los analitos de la matriz) y derivatización de la  BZE que permita transformarla en un analito con la volatilidad adecuada para éste análisis. Cada una de estas etapas si se realizan en forma manual involucran mucho tiempo. Por esta razón, en los últimos tiempos, se ha tratado de automatizar la etapa de tratamiento de la muestra, para ello, se han utilizado las técnicas en flujo continuo que permiten acoplar sistemas de extracción líquido-líquido (ELL) o en fase sólida (EFS). Es importante señalar que estas técnicas en flujo operan a baja presión y para la EFS en línea se deben seleccionar precolumnas de extracción con empaques especiales: material de acceso restringido (RAM), monolíticas, soportes de partículas grandes (OASIS HLB) que por sus características no generan presiones altas. En ese sentido, en el presente trabajo se desarrolló un método para evaluar COC y BZE en muestras de orina humana, por cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas (CG-EM), con tratamiento de la muestra en línea en un sistema de inyección en flujo multijeringa (MSFIA) de última generación y posterior derivatización de los analitos asistida por microondas.   Materiales y Métodos Para el desarrollo de este trabajo, se contó con muestras de orina de individuos consumidores. Previo al análisis las muestras se centrifugaron a 3000 r.p.m. durante 15 minutos, luego se filtraron con membranas de 0,45 μm (suport® -450 Membrana, Waters, USA) para evitar cualquier tipo de material en suspensión que pudiera ocasionar una obstrucción en los poros del material de empaque de la precolumna o en las conexiones del sistema MSFIA.   Procedimiento Para llevar a cabo el estudio se empleó un sistema de inyección en flujo de última generación (MSFIA). En la Fig. 1 se presenta un diagrama esquemático del sistema utilizado, que permitió llevar a cabo la limpieza y elución de los analitos de interés en una precolumna OASIS HLB (Waters), incorporada al sistema. El procedimiento que se siguió para llevar a cabo esta etapa se resume en la Tabla 1. ![Figura 1 Sistema Multijeringa.jpg]() 

El procedimiento involucra tres etapas: Tratamiento de la muestra (MSFIA): inicialmente se lleva a cabo el acondicionamiento de la precolumna haciendo pasar en el sistema a través de la jeringa 3 (J3) 5,0 mL de metanol/agua (90:10 v/v) a un flujo de 0,6 mL/min, una vez finalizada esta etapa se procede a eliminar el solvente orgánico presente dispensando a partir de la jeringa 1(J1), 1,0 mL de agua. Nuevamente la jeringa 1, acoplada a la válvula solenoide V1 (off) aspira los 0,100 mL de muestra. Posteriormente la V1 cambia de posición (on) introduciendo la muestra en la precolumna OASIS HLB, donde la COC y BZE son retenidas mientras que los compuestos endógenos son llevados a desecho. Una vez finalizada la etapa de limpieza, es la jeringa 2 (J2) (acetonitrilo) quien se encarga de eluir a los analitos de la precolumna. Derivatización (MW): una vez eluidos los analitos se procede a la etapa de derivatización asistida por microondas empleando BSTFA con 1% de TMCS como reactivo derivatizante en acetonitrilo (proporción 1:1 v/v), empleando una potencia de 630 W y 90 s. Separación: finalizada la derivatización se procede a inyectar la muestra en el sistema CG-EM bajo las condiciones cromatográficas que se resumen en la Tabla 2. ![Tabla 1 .jpg]()![Tabla 2.jpg]() Resultados y Discusión El empaque de la precolumna OASIS HLB (Waters) consiste de una proporción equilibrada de dos monómeros: N-vinilpirrolidona (carácter hidrofílico) y divinilbenceno (carácter lipofílico) y permite la retención de compuestos de diferente polaridad. En ese sentido permitió la retención de la COC (molécula lipofílica) y de la BZE (hidrofílica) durante un tiempo superior a los 10 minutos con una fase móvil de extracción constituida por agua a un flujo de 0,6 mL/min. Posteriormente, se llevó a cabo el estudio para seleccionar el solvente de elución de los analitos de la precolumna, donde se debía tener en cuenta su elución cuantitativa de la precolumna y además no poseer átomos de hidrógeno activos que afectaran la eficiencia de la reacción de derivatización. Los mejores resultados se lograron empleando acetonitrilo como solvente de elución. Adicionalmente, se optimizaron los parámetros del sistema MSFIA para establecer las mejores condiciones para llevar a cabo el análisis. Se varió el flujo de introducción de la muestra en la pre-columna, el flujo de elución de los analitos y el volumen de muestra. Los mejores resultados que significaron un buen compromiso entre sensibilidad satisfactoria, sin sobrepresiones en el sistema, sin formación de burbujas que afectaban la reproducibilidad de los resultados y sin pérdida de los analitos fueron: flujos de la fase de extracción y de elución de 0,6 mL/min y un volumen de inyección de la muestra de 0,100 mL. Posteriormente, se optimizaron las condiciones para realizar la derivatización asistida por microondas, estudiando tanto la potencia (240 - 630 W) como el tiempo de irradiación (60 – 240 s). Una potencia de 630 W en un tiempo de 1,5 min permitió llevar a cabo esta etapa con un buen rendimiento y reproducibilidad. De esta forma se pudo disminuir el tiempo de reacción de 30 min (en baño de agua) a 1,5 min. Finalmente se inyectó el producto de la reacción de derivación en el sistema cromatográfico bajo las condiciones optimizadas que se muestran en la Tabla 2. En la Fig. 2 se presentan los cromatogramas obtenidos. ![Cromatogramas.jpg]() Para evaluar el efecto de matriz en el análisis, se realizaron curvas de calibrado de soluciones patrones de COC (0,03 – 2,00 µg/mL) y BZE (0,25 – 3,00 µg/mL) y de muestras de orina enriquecidas con los analitos empleando el método de adición de estándar, observando que no hay diferencias significativas entre las pendientes de las curvas, por lo que no hay interferencia de matriz. La validación del procedimiento se evaluó además, a través de estudios de precisión y exactitud. Para ello se realizaron análisis consecutivos de muestras de orina enriquecidas con los analitos a diferentes niveles de concentración (0,125; 0,250; 0,500; 1,00 µg/mL) durante un día y en días diferentes. La precisión para ambos analitos fue satisfactoria con una desviación estándar relativa inferior al 4,0 % (n=5) para todos los casos. Para evaluar la exactitud del método se llevaron a cabo estudios de recuperación donde se pudo observar que los valores de los porcentajes de recuperación se encuentran por encima del 95 % con un coeficiente de variación  2,5%, esto demuestra la excelente eficiencia de extracción de la precolumna Oasis HLB empleada. Utilizando el método propuesto se estudiaron 18 muestras de orina de individuos consumidores, encontrando niveles de concentración de 0,12 - 0,79 µg/mL y 0,36 – 2,46 µg/mL de COC y BZE respectivamente. Conclusiones Los resultados obtenidos, indican que el sistema MSFIA permite llevar a cabo el tratamiento de la muestra en un tiempo de 4,5 min. Adicionalmente, el empleo de microondas para asistir la reacción derivatización de BZE permitió disminuir el tiempo de reacción de 30 min a 1.5 min. Finalmente, la sensibilidad y precisión alcanzada en el método propuesto así como una frecuencia de análisis de 10 muestras/hora hace que pueda ser utilizado como un método de rutina para estudios farmacocinéticos así como también de seguimiento de tratamientos clínicos. Bibliografía (1) Brunetto, M.R. Delgado, Y. Gutiérrez, L. Gallignani, M. Obando, M.A.. Determination of cocaine and benzoylecgonine by direct injection of human urine into a column-switching liquid chromatography system with diode-array detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 37, 115–120, 2005. (2) Miró, M. Cerdà, V. Estela, J. Multisyringe Flow Injection Analysis: Characterization and Applications. Trends in Analytical Chemistry. 21 (3), 199-210, 2002