OOO을 해보자.

riverbrane (45)in #busy • 7 years ago (edited)

예전에 포스팅을 통해 openOOO을 소개했고, 이를통해 직접 OOO 기계를 만들어볼수 있습니다. 드론자세제어등 피드백제어에 쓰이는 PID제어에 대해서도 설명을 했고,
사실 OOO는 온도제어가 거의 모든 것이라고 할 수 있습니다.

이번에는 직접 OOO을 해보도록 하죠.

DNA를 추출하는 방법은 대상 세포의 종류에 따라 차이가 있습니다.
대장균은 꼬마선충의 세초에 비해 더 쉽고, 식물세포는 더 복잡한 과정을 거칩니다.
대장균과 같은 세균은 복잡한 처리를 하지 않고도 세제 성분만으로 쉽게 세포를 깰 수 있습니다.

꼬마 선충은 여러가지 장점으로 연구분야에 많이 활용됩니다. 현미경으로 관찰해 보시면 왜 elegans인지 아실 겁니다.

팁을 이용해 예쁜 꼬마선충을 e-tube에 넣는다.(대장균의 경우 Proteinase K를 생략하고, 시약도 반으로 줄인다.)
세포 용해액(Al buffer) 300μl과 단백질 분해효소(Proteinase k) 1μl를 넣는다.
→55℃ Heat block에 1시간 동안 넣어둔다.
식힌 뒤에 RNase(RNA 분해효소) 1μ를 넣는다.
→37℃ Heat block에 15분간 둔다.
단백질 응고액(PP buffer)을 넣고 잘 섞는다.
→단백질 응고액(PP buffer)를 10분이상 돌린다.
찌꺼기는 버려 두고 상층액만 새 E-tube에 옮기고 이소프로파놀(단백질 응고액(PP buffer), 없는 경우 에탄올도 가능)을 300μl 넣는다.
→원심분리기를 10분이상 돌린다.
이번에는 상층액을 버린 후에 70% 에탄올을 300μl 넣는다.
6번 반복
에탄올이 남지 않도록 말린 후에, 증류수 등을 50μl를 넣어 dna를 녹인다.

세균과 달리 동물 조직은 세포끼리 단단하게 묶여 있기 때문에, 가능한 작게 잘라준 뒤 단백질 분해 효소를 처리해 주어야 쉽게 깨뜨릴 수 있습니다. 이 효소는 55℃ 부근에서 가장 잘 작동합니다.
RNA 분해효소는 37℃ 부근에서 가장 잘 작동하지만 55℃ 부근에서는 고장납니다. 따라서 단백질 분해효소 처리후 반드시 식혀야
RNA를 제대로 제거힐 수 있다.(깨끗한 DNA 추출)
세포 용해액에는 주로 세제 성분과 DNA 분해효소 억제제가 들어 있다.
DNA는 에탄올 농도가 높을때 하얗게 침전된다.

OOO 프로토콜

OOO premix( OOO반응이 가능하게 모든 효소와, dNTP, 버퍼 등등이 들어있음.)에 추출한 dna 2μl를 넣는다.
→OOO premix에는 Taq-polymerase , dNTP, OOO reaction buffer가 들어있다.
OOO reaction buffer는 pH 안정화(Tris-HCl), 효소 활성의 보조인자 공급(MgCl2나 MgSO4), 효소 안정화(BSA, KCl, Tween20, Tripton X-100)의 역할을 한다.
Forward primer (3'-5'에 붙음)2μl를 넣는다.
Reverse primer 2μl를 넣는다.
증류수 10μl를 넣고 튜브를 닫고 잘 섞이도록 가볍게 쳐 준다.
OOO튜브 아래로 용액이 모이도록 spin down.
OOO기계에 넣는다.
a. Pre-denaturation : 95℃ 5min
→ 예열, 단일가닥으로 풀어줌
b. Denaturation : 95℃ 30sec
→ 열을 가해 단일가닥으로 풀어줌
c. Annealing : 60℃ 30sec
→ Primer가 자리를 찾아가 붙는 과정
d. Extension : 72℃ 1min
→ DNA 합성이 일어남
e. Fin-Extension : 72℃ 10min
→ 중합효소가 충분히 반응하도록 함